Подходы к редактированию генома сельскохозяйственных животных

Представлены результаты исследования генетических методов создания сельскохозяйственных животных с улучшенными характеристиками. В настоящее время получено значительное количество животных с отредактированным геномом. Методы модификации генома у крупного рогатого скота (КРС) постоянно совершенствуются. Изучены подходы генного редактирования эмбрионов крупного рогатого скота, доставки отредактированных конструкций, повышения выживаемости эмбрионов после внесения систем редактирования. Исследования проводили на эмбрионах КРС. Разработаны и апробированы системы редактирования генов BLG и СД209. Изучены варианты доставки системы редактирования в клетки КРС: микроинъекция в зиготу плазмидной ДНК с закодированной последовательностью с CRISPR/Cas9 c sgRNA, способ вирусных векторов (аденоассоциированные вирусы AAV, серотипы AAV1, AAV2, AAV6, AAV9, AAVDJ), совместное введение плазмидной ДНК и сперматозоида в ооцит на стадии MII, а также микроинъекции РНК Cas9 и гидовых РНК. Исследованы и усовершенствованы различные методики выполнения микроинъекций и опробованы различные варианты приготовления смеси РНК Cas9 и гидовых РНК. На основе полученных результатов оптимизирован протокол выполнения микроинъекции системы редактирования и проведен модельный эксперимент на 160 ооцитах, по 80 клеток на каждую конструкцию. В результате установили, что эффективность редактирования в целом повысилась. При инъекции гидовой РНК против гена BLG и мРНК spCas9 дробление начали 84% выживших клеток, бластуляция составила 20%, оказались с нокаутом по BLG – 69,2%. При инъекции против гена CD209 и мРНК spCas9 дробление начали 44,4% выживших эмбрионов, бластуляция составила 16,7%, с нокаутом по CD209 – 44,4%. Новизна работы заключается в получении данных о разработке систем редактирования с определенными генами-мишенями, в усовершенствовании системы доставки и культивирования эмбрионов КРС.

1. Fei Hao, Wei Yan, Xiaocong Li, Hui Wang, Yingmin Wang, Xiao Hu, Xu Liu, Hao Liang, Dongjun Liu. Generation of Cashmere Goats Carrying an EDAR Gene Mutant Using CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing // International Journal of Biological Sciences. 2018. Vol. 14 (4). P. 427–436. DOI: 10.7150/ijbs.23890.

2. Jenny-Helena Söllner, Hendrik Johannes Sake, Antje Frenzel, Rita Lechler, Doris Herrmann, Walter Fuchs, Björn Petersen. In vitro genome editing activity of Cas9 in somatic cells after random and transposon-based genomic Cas9 integration // PLoS One. 2022. Vol. 17 (12). P. 0279123. DOI: 10.1371/journal.pone.0279123.

3. Honghui Li, Wenmin Cheng, Bowei Chen, Shaoxia Pu, Ninglin Fan, Xiaolin Zhang, Deling Jiao, Dejia Shi, Jianxiong Guo, Zhuo Li, Yubo Qing, Baoyu Jia, Hong-Ye Zhao, Hong-Jiang Wei. Efficient Generation of P53 Biallelic Mutations in Diannan Miniature Pigs Using RNA-Guided Base Editing // Life (Basel). 2021. Vol. 11 (12). P. 1417. DOI: 10.3390/life11121417.

4. Haokun Zhang, Ruilin Sun, Jian Fei, Hongyan Chen, Daru Lu. Correction of Beta-Thalassemia IVS-II-654 Mutation in a Mouse Model Using Prime Editing // International Journal of Molecular Sciences. 2022. Vol. 23 (11). P. 5948. DOI: 10.3390/ijms23115948.

5. Ryu J., Statz J.P., Chan W., Burch F.C., Brigande J.V., Kempton B., Porsov E.V., Renner L., McGill T., Burwitz B.J., Hanna C.B., Neuringer M., Hennebold J.D. CRISPR/Cas9 editing of the MYO7A gene in rhesus macaque embryos to generate a primate model of Usher syndrome type 1B // Scientific Reports. 2022. Vol. 1. P. 10036. DOI: 10.1038/s41598-022-13689-x.

6. Lin Y., Li J., Li C., Tu Z., Li S., Li X.J., Yan S. Application of CRISPR/Cas9 System in Establishing Large Animal Models // Frontiers in Cell and Developmental Biology. 2022. Vol. 10. P. 919155. DOI: 10.3389/fcell.2022.919155.

7. Menchaca A., Dos Santos-Neto P.C., Souza-Neves M., Cuadro F., Mulet A.P., Tesson L., Chenouard V., Guiffès A., Heslan J.M., Gantier M., Anegón I., Crispo M. Otoferlin Gene Editing in Sheep via CRISPR-Assisted ssODN-Mediated Homology Directed Repair // Scientific Reports. 2020. Vol. 10 (1) . P. 5995. DOI: 10.1038/s41598-020-62879-y.

8. Karponi G., Kritas S.K., Papadopoulou G., Akrioti E.K., Papanikolaou E., Petridou E. Development of a CRISPR/Cas9 system against ruminant animal brucellosis // BMC Veterinary Research. 2019. Vol. 15. P. 422. DOI: 10.1186/s12917-019-2179-z.

9. De Graeff N., Jongsma K.R., Johnston J., Hartley S., Bredenoord A.L. The ethics of genome editing in non-human animals: A systematic review of reasons reported in the academic literature // Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 2019. Vol. 374. P. 20180106. DOI: 10.1098/rstb.2018.0106.

10. Yang H., Wang H., Shivalila C.S. et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering // Cell. 2013. Vol. 154. P. 1370–1379.

11. Danilov K.A., Vassilieva S.G., Polikarpova A.V., Starikova A.V., Shmidt A.A., Galkin I.I., Tsitrina A.A., Egorova T.V., Orlov S.N., Kotelevtsev Y.V. In vitro assay for the efficacy assessment of AAV vectors expressing microdystrophin // Experimental Cell Research. 2020. Vol. 392. P. 112033. DOI: 10.1016/j.yexcr.2020.112033.

12. Krivonogova А.S., Bruter A.V., Makutina V.A., Okulova Y.D., Ilchuk L.A., Kubekina M.V., Khamatova A.Y., Egorova T.V., Mymrin V.S., Silaeva Y.Y., Deykin A.V., Filatov M.A., Isaeva A.G. AAV infection of bovine embryos: Novel, simple and effective tool for genome editing // Theriogenology. 2022. Vol. 193. P. 77–86.