Применение молекулярных методов для идентификации Clostridium sporogenes, Clostridium perfringens и Clostridium sordellii, выделенных от крупного рогатого скота

Представлены результаты исследований по разработке эффективного метода видовой идентификации клостридий Clostridium sporogenes, Clostridium perfringens и Clostridium sordellii, основанного на полимеразной цепной реакции (ПЦР), а также возможности его практического использования для диагностики клостридиозов крупного рогатого скота. Всего исследовали 90 проб биологического материала, отобранных от больных животных в хозяйствах Новосибирской области в 2023 г., которые изучали бактериологическим и биохимическим методами. ПЦР проводили c детекцией в реальном времени. Полученные результаты подтверждали секвенированием ПЦР-фрагментов гена 16S рРНК. В результате бактериологических исследований, изучения культурально-морфологических и биохимических свойств идентифицировали 44 изолята клостридий, принадлежащих к девяти видам. Выбраны три пары праймеров и зондов для амплификации фрагментов генов gerKA C. sporogenes, plc C. perfringens и NanS C. sordellii. В результате экспериментальных исследований определили рабочие концентрации праймеров и зондов, обеспечивающих необходимую чувствительность метода, оптимизировали условия проведения ПЦР. Специфичность выбранных олигонуклеотидов проверяли с использованием штаммов клостридий других видов и бактерий других видов. Чувствительность ПЦР составила при исследовании чистых культур бактерий не менее 102КОЕ/мл, суспензий из проб биоматериала – не менее 105 КОЕ/мл. В сравнении с непосредственным исследованием проб биоматериала в смешанных культурах бактерий, выделенных из этих же проб на питательных средах, количество положительных результатов было выше (53 и 37% соответственно). Разработанный метод позволяет в более короткие сроки и эффективнее проводить диагностику клостридиозов крупного рогатого скота. Чувствительность разработанного метода выше при исследовании бактериальных культур, выделенных на питательных средах, чем при непосредственном исследовании проб биоматериала. Последующее более детальное изучение молекулярно-генетических характеристик выявленных изолятов клостридий на наличие генов токсинов позволит определить их потенциальную токсигенность и роль в развитии болезни. 

1. Судоргина Т.Е., Глотова Т.И., Котенева С.В., Нефедченко А.В., Велькер Д.А., Глотов А.Г. Клостридиозы крупного рогатого скота: характеристика основных возбудителей, меры профилактики и борьбы (обзор, часть 1) // Ветеринария. 2023. № 5. С. 3–10. DOI: 10.30896/0042-4846.2023.26.5.03-09.

2. Uzal F.A., Navarro M.A., Li J., Freedman J.C., Shrestha A., McClane B.A. Comparative pathogenesis of enteric clostridial infections in humans and animals // Anaerobe. 2018. Vol. 53. P. 11–20. DOI: 10.1016/j.anaerobe.2018.06.002.

3. Данилюк А.В., Капустин А.В. Распространенность и видовое разнообразие клостридий – возбудителей анаэробных инфекций крупного рогатого скота // Труды всероссийского НИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко. 2019. № 81. С. 19–26. DOI: 10.30917/ATT-PRINT-2019-10.

4. Глотова Т.И., Котенева С.В., Нефедченко А.В, Велькер Д.А., Глотов А.Г. Этиологические агенты, вызывающие патологию воспроизводства у коров на молочных комплексах // Ветеринария. 2023. № 2. С. 3–8. DOI: 10.30896/0042-4846.2023.26.2.03-08.

5. Simpson K.M., Callan R.J., Van Metre D.C. Clostridial abomasitis and enteritis in ruminants // Veterinary clinics of north america: food animal practice. 2018. Vol. 34. P. 155–184. DOI: 10.1016/j.cvfa.2017.10.010.

6. Jerram L. Clostridial disease in cattle // Livestock. 2019. Vol. 24. P. 274–279. DOI: 10.12968/live.2019.24.6.274.

7. Kiu R., Hall L.J. An update on the human and animal enteric pathogen Clostridium perfringens // Emerging microbes & infections. 2018. Vol. 7 (1). P. 141. DOI: 10.1038/s41426-018- 0144-8.

8. Navarro M.A., Uzal F.A. Pathobiology and diagnosis of clostridial hepatitis in animals // Journal of veterinary diagnostic investigation. 2020. Vol. 32. P. 192–202. DOI: 10.1177/1040638719886567.

9. Bakhtiary F., Sayevand H.R., Remely M., Hippe B., Indra A., Hosseini H., Haslberger A.G. Identification of Clostridium spp. derived from a sheep and cattle slaughterhouse by matrix-assisted laser desorption and ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) and 16S rDNA sequencing // Journal of food sci ence and technology. 2018. Vol. 55 (8) P. 3232– 3240. DOI: 10.1007/s13197-018-3255-2.

10. Rood J.I., Adams V., Lacey J., Lyras D., McClane B.A., Melville S.B., Moore R.J., Popoff M.R., Sarker M.R., Songer J.G., Uzal F.A., Van Immerseel F. Expansion of the Clostridium perfringens toxin-based typing scheme // Anaerobe. 2018. Vol. 53. P. 5–10. DOI: 10.1016/j.anaerobe.2018.04.011.

11. Loy J.D., Clawson M.L., Adkins P.R.F., Middleton J.R. Current and Emerging Diagnostic Approaches to Bacterial Diseases of Ruminants // Veterinary clinics of north america: food animal practice. 2023. Vol. 39. N 1. P. 93–114. DOI: 10.1016/j.cvfa.2022.10.006.

12. Richter V., Roch F.F., Knauss M., Hiesel J., Wolf R., Wagner P., Käsbohrer A., Conrady B. Animal-related factors predicting fatal cases of blackleg and gas gangrene in cattle // Veterinary record. 2021. Vol. 189 (10). P. e558. DOI: 10.1002/vetr.558.

13. Abusnina W., Shehata M., Karem E., Koc Z., Khalil E. Clostridium sporogenes bacteremia in an immunocompetent patient // IDCases. 2019. Vol. 15. P. e00481. DOI: 10.1016/j.idcr.2018. e00481.