Preview

Сибирский вестник сельскохозяйственной науки

Расширенный поиск

Адаптация метода определения активности нитратредуктазы для массовых анализов растений

https://doi.org/10.26898/0370-8799-2019-6-3

Аннотация

Изучена возможность лиофильного высушивания растительного материала и его измельчения в вибрационной шаровой мельнице для определения активности нитратредуктазы (НР). Показана эффективность применения данного подхода для массовых анализов сельскохозяйственных культур. Работа проведена на проростках мягкой пшеницы (Triticum aestivum) следующих сортов: озимых Алтиго, Васса, Гром, Дока, Собербаш, Старшина, Фишт и яровой пшеницы Новосибирская 67. Растения выращивали в течение четырех-пяти недель на субстрате без азота и на субстрате с добавкой 50 миллимоль/л (мМ) нитрата калия. Нитратредуктаза в растениях сохраняла свою активность после лиофилизации и измельчения высушенных листьев в мельнице. Применение разработанного метода корректно для образцов, содержащих активность НР, необходимую для образования нитрита в пределах 5–120 микромоль/л (мкМ) в 800 мкл реакционной смеси (например, порошок из лиофилизированных 100 мг листьев проростков пшеницы). Центрифугирование растительного лизата при 20 000 g практически не меняло результата определения активности НР по сравнению с более доступным центрифугированием при 12 000 g. Лизаты из свежих листьев проростков пшеницы содержали существенно больше общего белка, чем лизаты из лиофилизированных листьев (из расчета на одинаковое количество стартового материала). Различие лизатов из свежих и лиофилизированных листьев в способности восстанавливать нитрат была меньше, чем различие в концентрации белка. В результате активность НР в пересчете на общий белок у лиофилизированных листьев выше. Активность НР значительно индуцировалась присутствием нитрата во всех сортах. Базовая и индуцированная активности НР существенно варьировали между разными сортами пшеницы, при выращивании с нитратом активность возрастала от 2,5 раза для Новосибирской 67 и 2,7 – для Васса до 5,4 – для Алтиго и 5,7 раза для Гром.

Об авторах

Г. И. Карлов
Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологи
Россия

академик РАН, доктор биологических наук, директор Всероссийского научноисследовательского института сельскохозяйственной биотехнологии

Москва



Д. Ю. Литвинов
Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологи; Национальный медицинский исследовательский центр профилактической медицины
Россия

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник; адрес для переписки

127550, Москва, Тимирязевская, 42



П. Н. Харченко
Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологи
Россия

академик РАН, доктор биологических наук, научный руководитель Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной биотехнологии

Москва



П. Ю. Крупин
Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологи; Центр молекулярной биотехнологии, Российский государственный аграрный университет – Московская сельскохозяйственная академия имени К.А. Тимирязева
Россия

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

Москва



С. Ю. Ширнин
Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологи
Россия

младший научный сотрудник

Москва



А. Г. Черноок
Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологи
Россия

младший научный сотрудник

Москва



Л. А. Назарова
Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологи
Россия

младший научный сотрудник

Москва



М. Г. Дивашук
Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологи; Центр молекулярной биотехнологии, Российский государственный аграрный университет – Московская сельскохозяйственная академия имени К.А. Тимирязева
Россия

кандидат биологических наук, заведующий лабораторией прикладной геномики и частной селекции сельскохозяйственных растений

Москва



Список литературы

1. Морозкина Е.В., Звягильская Р.А. Нитратредуктазы: структура, функции, влияние факторов стресса // Биохимия. 2007. Т. 72, № 10. С. 1413–1424. DOI: 10.1134/ s0006297907100124.

2. Johnson C., Whittington W., Blackwood G. Nitrate reductase as a possible predictive test of crop yield // Nature. 1976. Vol. 262, N 5564. P. 133–134. DOI: 10.1038/262133a0.

3. Nigro D., Gadaleta A., Mangini G., Colasuonno P., Marcotuli I., Giancaspro A., Giove S.L., Simeone R., Blanco A. Candidate genes and genome-wide association study of grain protein content and protein deviation in durum wheat // Planta. 2019. Vol. 249, N 4. P. 1157–1175. DOI: 10.1007/s00425-018-03075-1.

4. Zhao X.Q., Nie X.L., Xiao X.G. Over-expression of a tobacco nitrate reductase gene in wheat (Triticum aestivum L.) increases seed protein content and weight without augmenting nitrogen supplying // PLoS One. 2013. Vol. 8, N 9. P. e74678. DOI: 10.1371/journal. pone.0074678.

5. Gao Z., Wang Y., Chen G., Zhang A., Yang S., Shang L., Wang D., Ruan B., Liu C., Jiang H., Dong G., Zhu L., Hu J., Zhang G., Zeng D., Guo L., Xu G., Teng S., Harberd N.P., Qian Q. The indica nitrate reductase gene OsNR2 allele enhances rice yield potential and nitrogen use effi ciency // Nat Commun. 2019. Vol. 10, N 1 P. 5207. DOI: 10.1038/s41467-01913110-8.

6. Yi J., Gao J., Zhang W., Zhao C., Wang Y., Zhen X. Differential Uptake and Utilization of Two Forms of Nitrogen in Japonica Rice Cultivars From North-Eastern China. // Front Plant Sci. 2019. Vol. 4, N 10 P. 1061. DOI: 10.3389/ fpls.2019.01061.

7. Bolshakova L.S., Bulgakova N.N. Effect of nitrate nutrition on nitrate compartmentation, nitrate reductase activity and productivity in spring wheat. Wheat: Prospects for Global Improvement. Developments in Plant Breeding, Vol 6. Springer, Dordrech, 1997. P. 437–443. DOI 10.1007/978-94-011-4896-2_58.

8. Yanagisawa S. Transcription factors involved in controlling the expression of nitrate reductase genes in higher plants // Plant Sci. 2014. Vol. 229. P. 167–171. DOI: 10.1016/j. plantsci.2014.09.006.

9. Клименко С.Б., Пешкова А.А., Дорофеев Н.В. Активность нитратредуктазы у озимой пшеницы при тепловом шоке // Журнал стресс-физиологии и биохимии. 2006. Т. 2. № 1. С. 50–56.

10. Sherrard J. H., Dalling M. J. In vitro stability of nitrate reductase from wheat leaves: I. Stability of highly purifi ed enzyme and its component activities // Plant Physiol. 1979. Vol. 63. N 2. P. 346–353. DOI: 10.1104/pp.63.2.346.

11. Evans H.J., Nason A. Pyridine nucleotide-nitrate reductase from extracts of higher plants // Plant Physiol. 1953. Vol. 28. N 2. P. 233–254. DOI: 10.1104/pp.28.2.233.

12. Gibon Y., Blaesing O. E., Hannemann J., Carillo P., Höhne M., Hendriks J.H., Palacios N., Cross J., Selbig J., Stitt M. A Robot-based platform to measure multiple enzyme activities in Arabidopsis using a set of cycling assays: comparison of changes of enzyme activities and transcript levels during diurnal cycles and in prolonged darkness // Plant Cell. 2004. Vol. 16, N 12. P. 3304–3325. DOI: 10.1105/ tpc.104.025973.

13. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of proteindye binding // Analytical Biochemistry. 1976. Vol. 72. P. 248–254. DOI: 10.1006/ abio.1976.9999.


Рецензия

Для цитирования:


Карлов Г.И., Литвинов Д.Ю., Харченко П.Н., Крупин П.Ю., Ширнин С.Ю., Черноок А.Г., Назарова Л.А., Дивашук М.Г. Адаптация метода определения активности нитратредуктазы для массовых анализов растений. Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. 2019;49(6):23-33. https://doi.org/10.26898/0370-8799-2019-6-3

For citation:


Karlov G.I., Litvinov D.Y., Kharchenko P.N., Krupin P.Yu., Shirnin S.Yu., Chernook A..., Nazarova L.А., Divashuk M.G. Adaptation of nitrate reductase activity assay for high throughput screening of crops. Siberian Herald of Agricultural Science. 2019;49(6):23-33. (In Russ.) https://doi.org/10.26898/0370-8799-2019-6-3

Просмотров: 456


Creative Commons License
Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.


ISSN 0370-8799 (Print)
ISSN 2658-462X (Online)